Étude de la reconnaissance des Escherichia coli adhérents et invasifs (AIEC) associés à la maladie de Crohn par l'autophagie : identification des récepteurs autophagiques et des facteurs de virulence - Microbes, Intestin, Inflammation et Susceptibilité de l'Hôte Access content directly
Theses Year : 2023

Study of the recognition of Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli (AIEC) by autophagy : identification of autophagic receptors and virulence factors

Étude de la reconnaissance des Escherichia coli adhérents et invasifs (AIEC) associés à la maladie de Crohn par l'autophagie : identification des récepteurs autophagiques et des facteurs de virulence

Abstract

Crohn's disease (CD) is a chronic inflammatory bowel disease, of which the etiology is multifactorial. It results from the complex interaction between genetic predispositions, environmental factors and alterations in the intestinal microbiota composition, inducing a deregulation of the intestinal immune system. To date, CD is incurable, only treatments aimed at alleviating symptoms and preventing recurrences and complications are available. In CD patients, an increase in the prevalence of particular strains of Escherichia coli, called AIEC (adherent-invasive E. coli) strains, has been reported. AIEC are the pathobionts able to adhere to and to invade intestinal epithelial cells as well as replicate inside macrophages without inducing cell death, leading to a dysregulated immune response. Furthermore, it has been shown that several polymorphisms in autophagy-related genes (ATG16L1, IRGM, ULK1, etc.) are associated with an increased risk to develop CD. Autophagy is an essential process for maintaining cellular homeostasis, which allows the degradation and recycling of cytoplasmic components and pathogens via the lysosome. However, some intracellular pathogens develop various strategies to escape autophagy degradation. In this context, the aim of my thesis was to identify the autophagic receptors responsible for AIEC recognition, as well as the genes necessary for AIEC to escape autophagy.The first part of my thesis showed that the depletion of p62 or NDP52 in HeLa cells leads to an increase in the intracellular replication of the AIEC LF82 reference strain and the production of pro-inflammatory cytokines. Confocal microscopy analysis revealed the colocalization of p62 or NDP52 with AIEC LF82 bacteria and LC3 protein, a marker of autophagy. Thus, our results suggest that p62 and NDP52 could act as autophagic receptors to control AIEC intracellular replication. Additionally, we investigated the impact of a polymorphism in the NDP52 gene associated with increased susceptibility to develop CD, called NDP52Val248Ala, on the control of AIEC. No difference was observed in the AIEC LF82 intracellular number between HeLa cells expressing the NDP52Val248Ala risk variant and those expressing the wild-type allele, suggesting another role for this variant, probably in the control of inflammation.The second part of my thesis focused on the identification of the genes necessary for AIEC to escape from autophagy control by the Transposon Sequencing (Tn-Seq) technique. Briefly, a mutant library of the AIEC LF82 strain was created in a “saturated” manner, meaning that each gene of the bacterial genome was inserted by at least one transposon, leading to its invalidation. This mutant library was used to infect control and autophagy-deficient HeLa cells. At 24 hours post-infection, the mutants DNA was extracted and transposon insertion sites determined by sequencing allowed the identification of 68 genes differentially represented between our two conditions. The genes over-represented in autophagy-deficient HeLa cells compared to control cells, are potential genes necessary for AIEC to escape from autophagy control. Thus, this study could allow the identification of new targets to limit the virulence of AIEC.In conclusion, this work contributes to the understanding of various aspects of the interaction between host cells and CD-associated AIEC bacteria and, in the future, will aide to better characterize the etiopathogenesis of this disease.
La maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique de l'intestin, dont l'étiologie est multifactorielle. Elle résulte de l'interaction complexe entre des prédispositions génétiques, des facteurs environnementaux et des altérations de la composition du microbiote intestinal, induisant une dérégulation du système immunitaire intestinal. À ce jour, la MC est incurable, seuls des traitements visant à soulager les symptômes et à prévenir les récidives et complications sont disponibles. Chez les patients atteints de la MC, une augmentation de la prévalence de souches particulières d'Escherichia coli, appelées les AIEC (adherent-invasive E. coli), a été rapportée. Les AIEC sont des pathobiontes capables d'adhérer et d'envahir les cellules épithéliales intestinales ainsi que de se répliquer en macrophages sans induire la mort cellulaire, entraînant une réponse immunitaire dérégulée. Par ailleurs, des études ont montré que plusieurs polymorphismes dans les gènes de l'autophagie (ATG16L1, IRGM, ULK1, etc.) sont associés à un risque augmenté de développer la MC. L'autophagie est un processus essentiel au maintien de l'homéostasie cellulaire permettant la dégradation et le recyclage de composants cytoplasmiques et de pathogènes via le lysosome. Toutefois, certains pathogènes intracellulaires développent diverses stratégies pour échapper à la dégradation par l'autophagie. Dans ce contexte, l'objectif de mes travaux de thèse était d'identifier les récepteurs autophagiques responsables de la reconnaissance des AIEC, ainsi que les gènes nécessaires aux AIEC pour échapper à l'autophagie.Le 1er axe de mes travaux de thèse a montré que la déficience de p62 ou NDP52 dans les cellules HeLa entraîne une augmentation de la réplication intracellulaire de la souche de référence AIEC LF82 et de la production de cytokines pro-inflammatoires. L'analyse par microscopie confocale a révélé la colocalisation de p62 ou NDP52 avec la bactérie AIEC LF82 et la protéine LC3, un marqueur de l'autophagie. Ainsi, nos résultats suggèrent que p62 et NDP52 agiraient comme des récepteurs autophagiques pour contrôler la réplication intracellulaire des AIEC. De plus, nous avons étudié l'impact d'un polymorphisme du gène NDP52 associé à une susceptibilité augmentée de développer la MC, appelé NDP52Val248Ala, sur le contrôle des AIEC. Aucune différence n'a été observée dans le nombre de bactéries AIEC LF82 intracellulaires entre les cellules HeLa exprimant le variant à risque NDP52Val248Ala et celles exprimant l'allèle sauvage, suggérant un autre rôle de ce variant, probablement dans le contrôle de l'inflammation.Le 2ème axe de mes travaux de thèse s'est concentré sur l'identification de gènes nécessaires aux AIEC pour échapper au contrôle par l'autophagie en utilisant la technique Transposon Sequencing (Tn-Seq). Brièvement, une banque de mutants de la souche AIEC LF82 a été créée de manière « saturée », c'est-à-dire que chacun des gènes du génome bactérien a été interrompu par au moins un transposon, conduisant à son invalidation. Cette banque de mutants a été utilisée pour infecter des cellules HeLa contrôles et déficientes pour l'autophagie. À 24h post-infection, l'ADN des mutants a été extrait et les sites d'insertion du transposon déterminés par séquençage ont permis d'identifier 68 gènes différentiellement représentés entre nos deux conditions. Les gènes sur-représentés dans les cellules HeLa déficientes pour l'autophagie par rapport aux cellules contrôles, sont les gènes potentiellement nécessaires aux AIEC pour échapper à l'autophagie. Ainsi, cette étude permettrait d'identifier de nouvelles cibles pour limiter la virulence des AIEC.En conclusion, ces travaux contribuent à la compréhension des divers aspects de l'interaction entre les cellules hôtes et les bactéries AIEC associées à la MC et permettront, à l'avenir, de mieux caractériser la pathogenèse de cette maladie.
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Cite

Alison da Silva. Étude de la reconnaissance des Escherichia coli adhérents et invasifs (AIEC) associés à la maladie de Crohn par l'autophagie : identification des récepteurs autophagiques et des facteurs de virulence. Médecine humaine et pathologie. Université Clermont Auvergne, 2023. Français. ⟨NNT : 2023UCFA0117⟩. ⟨tel-04543546⟩
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